液相色譜柱的使用與維護(hù)
液相色譜(HPLC)是20世紀(jì)60年代后期發(fā)展起來(lái)的分離分析技術(shù)，是現(xiàn)代分離測(cè)定的重要手段。問(wèn)世以來(lái)，因其具有分離效能高、分析速度快、檢測(cè)靈敏度好、能分析高沸點(diǎn)但不能氣化的熱不穩(wěn)定生理活性物質(zhì)的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、藥物及臨床分析。液相色譜是用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑，緩沖液等活動(dòng)相泵進(jìn)裝有固定相的色譜柱，經(jīng)進(jìn)樣閥注進(jìn)待測(cè)樣品，由活動(dòng)相帶進(jìn)柱內(nèi)，在柱內(nèi)各成分被分離后依次進(jìn)進(jìn)檢測(cè)器，色譜信號(hào)由記錄儀、積分儀或色譜工作站記錄。
色譜柱是液相色譜的心臟，在液相色譜儀的使用中，保持色譜柱的柱效、容量和滲透粉性，延長(zhǎng)柱子的使用壽命非常重要。因此對(duì)液相色譜柱的維護(hù)是關(guān)鍵。
1 色譜柱的構(gòu)造
色譜柱由柱管、壓帽、卡套(密封環(huán))、篩板(濾片)、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70㎏/㎝2時(shí)，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。為進(jìn)步柱效，減小管壁效應(yīng)，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過(guò)拋光。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細(xì)管柱。色譜柱兩真?zhèn)€柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或欽合金，孔徑0.2-20 μm(5-10μm)，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。
色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規(guī)格也不同:
(I)常規(guī)分析柱(常量柱)，內(nèi)徑2-5mm(常用4.6mm，國(guó)內(nèi)有4mm和5mm )，柱長(zhǎng)10-30cm ;
(2)窄徑柱，又稱細(xì)管徑柱、半微柱，內(nèi)徑1 -2mm ,柱長(zhǎng)10-20cm;
(3)毛細(xì)管柱(又稱微柱)，內(nèi)徑0.2-0.5mm;
(4)半制備柱，內(nèi)徑>5mm;
(5)實(shí)驗(yàn)室制備柱，內(nèi)徑20-40rnm，柱長(zhǎng)10-30cm;
(6)生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長(zhǎng)、填料粒徑和折合流速來(lái)確定，目的是為了避免管壁效應(yīng)。
2色譜柱的使用和維護(hù)
在日常分離分析工作中，色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，色譜柱使用是否得當(dāng)，直接影響色譜柱的壽命，稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操縱過(guò)程中，需要留意下列題目，以維護(hù)色譜柱。
(1)柱子在裝卸、更換時(shí)，動(dòng)作要輕，接頭擰緊要適度。必須防止較強(qiáng)的機(jī)械振動(dòng)，以免柱床產(chǎn)生空隙。
(2)假如儀器用來(lái)做常規(guī)分析，樣品種類有限，但分析次數(shù)多，則不妨為每一類常規(guī)分析配置一根柱，這樣有助于延長(zhǎng)柱子的壽命。
(3)避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的忽然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況;柱壓的忽然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過(guò)緩。
(4)應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬粗嗳弧?br />
(5)如使用柱溫控制裝置時(shí)，應(yīng)留意在通人活動(dòng)相后才能升溫。
(6)一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除往留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。
(7)選擇使用適宜的活動(dòng)相，以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一個(gè)預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使活動(dòng)相在進(jìn)進(jìn)分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。
8)避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注人柱內(nèi)，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一個(gè)保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。
(9)經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保存在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，對(duì)流路系統(tǒng)中活動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡，每種活動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50-75mL。
(10)保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)布滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。盡對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間。
(11)色譜柱使用過(guò)程中，假如壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗;另一種可能是大分子進(jìn)人柱內(nèi)，使柱頭被污染;假如柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。
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